Biotecnologie

Didascalia alternativa:

Probabilmente le specie 1 e 2 condividono un antenato comune più recente. 9 CE La fluorescenza è rimossa e la PCR prosegue. La reazione si ripete per tutti i nucleotidi della sequenza. Il genoma da sequenziare D è digerito con enzimi di restrizione, anche se di dimensioni diverse, alcuni frammenti sono in parte sovrapponibili. laser O ATTCATGAAGCACGGA sequenza 7 ATTCATGAAGCACGGACTY OR CATGAAGCATHARGESTACAT AGCACGGAETTGTCAACTACACGTA -sequenza 3 Le sequenze di tutti i frammenti vengono ordinate t che rimuove le parti sovrapposte e ricostruisce l'intera sequenza te tramite analisi computerizzat La DNA ligasi lega a ciascun filamento un oligonucleotide chiamato-codice a barre (in arancione). GTCAATACACATGATCAATGGGG 2 filamento Cin crescita sequenza 8 TCAATGGGGCTAA sequenza 5 La fluorescenza captata dal laser viene registrata da un computer, che restituisce le sequenze di ogni frammento. GGGCTAATGATTGTCAC Es. Esseri umani hanno un genoma simile al 98% GENOMICA La genomica funzionale è la disciplina che si pone l'obiettivo di identificare tutti i geni di un organismo e di determinarne la funzione -> Viene dimostrato che i geni codificanti per proteine rappresentano il 2% dell'intero genoma umano Il restante 98% rimane sconosciuto La bioinformatica è la branca della biologia che si occupa dell'analisi computerizzata di grandi quantità di dati biologici È possibile analizzare la sequenza di un organismo-> Separando le seguenze codificanti da quelle regolatrici ->Permette di identificare i geni che sono stati maggiormente conservati dall'evoluzione da quelli peculiari di certi organismi Svolgono funzioni fondamentali Svolgono funzioni specifiche per tutti i viventi Es. Geni per la glicolisi TGATTGTCACAT sequenza 1-CACATACACATEG sequenza 4- ACACATGGARATA ATGGGGCTAATGATTOTCACATACACATGGAAATA La genomica comparativa si occupa del confronto tra i genomi di organismi appartenenti a specie diverse, allo scopo di stabilirne le parentele evolutive -sequenza 2 sequenza 6 Le linee evolutive di umani e scimpanzé hanno iniziato a divergere 13 milioni di anni fa La sequenza che emerge complementare a quella che si intendeva sequenziare Maggiore è la differenza a livello nucleotidico tra i genomi di organismi di due specie diverse, maggiore sarà il tempo trascorso dalla separazione da un progenitore comune Es. Esseri umani e lievito di birra hanno il genoma somigliante solo per il 15% Hanno iniziato a divergere 1 miliardo di anni fa La metagenomica si occupa dell'analisi dei genomi di tutte le specie presenti in un determinato ambiente, al fine di valutare la biodiversità genetica →→> È possibile estrarre direttamente da un campione di acqua o di suolo tutto il DNA proveniente dagli organismi presenti e determinarne la sequenza La bioinformatica consente di assegnare a ciascuna sequenza di DNA a una determinata specie Si ottiene una fotografia della biodiversità genetica presente in un certo ambiente Es. In una goccia di acqua di mare sono stati identificati fino a 1 milione di virus e diverse migliaia di batteri Le estremità coesive facilitano la ricombinazione del DNA, ma solo le ligasi possono saldare tra loro i nucleotidi DNA AATTC AATTC GAATTO CITARG Taglio AATTC CTTAA DNA estraneo AATTO WID CTTAA AATTC DNA CTTANG Taglio AATTC CTTAA GAAG CTTAA DNA ricombinante Le cellule batteriche che ospitano il plasmide producono la GFP e brillano sotto la luce ultravioletta. fff WILD Le estremità coesive favoriscono la ricombinazione di frammenti di DNA, ma non sono sufficienti per saldarli ->L'unione sarà mantenuta solo dei legami a idrogeno tra le basi e i frammenti tenderanno a separarsi È necessario l'intervento delle DNA ligasi: Enzimi in grado di ricostituire il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti utilizzando ATP come cofattore Sono essenziali per le reazioni di duplicazione e riparazione del DNA Alcune DNA ligasi (come quella del batteriofago T4) possono saldare estremità piatte -> Reazione meno efficiente perché due frammenti non sono in grado di unirsi spontaneamente mancando dell'estremità complementari Gli enzimi di restrizione agiscono solo sul DNA estraneo e non tagliano il DNA della cellula che li produce -> Il batterio marca il proprio DNA aggiungendo un gruppo metile (-CH3) in tutti i punti del cromosoma batterico che potrebbero essere riconosciuti I segmenti che si formano in seguito all'azione di un determinato enzima di restrizione ono chiamati frammenti di restrizione Hanno una lunghezza che dipende dalla distanza dei siti in cui si trovano le sequenze di riconoscimento per quel dato enzima A seconda della posizione di tali sequenze, si possono ottenere frammenti contenenti un certo numero di geni o segmenti differenti I retrovirus utilizzano la trascrittasi inversa per convertire I'mRNA in una catena di DNA -> Allo stesso modo si può utilizzare un mRNA conosciuto perché faccia da stampo per una molecola di DNA complementare (o cDNA) Sarà più corto della DNA originale perché privo degli introni La DNA polimerasi e viene usata per sintetizzare il secondo filamento, complementare al primo-> Si ottiene una sequenza di DNA a doppio filamento che può essere inserita nel cromosoma della cellula ospite VETTORI PLASMIDICI Molecole di DNA circolare a doppia elica che vengono usate per spostare i geni da un organismo all'altro Tutti i vettori contengono una serie di elementi essenziali: Un'origine di replicazione per consentirne la duplicazione ogni volta che si verifica una divisione cellulare Tutte le cellule figlie conterranno il vettore e i corrispettivi geni Uno o più geni reporter: geni per la resistenza agli antibiotici Per selezionare le cellule contenenti il vettore Sequenze uniche di riconoscimento per diversi enzimi di restrizione Poste una vicino all'altra nel sito multiplo di clonaggio: una regione del plasmide dove verrà inserito il frammento di DNA esogeno Vettori di espressione: permettono di far esprimere il gene all'interno della cellula ricevente Contengono le sequenze regolatrici che consentono la trascrizione del gene ->Il sito multiplo di clonaggio è posizionato tra il promotore e il segnale di terminazione della trascrizione • Es. Il vettore di espressione che porta il gene che codifica la proteina fluorescente verde (GFP) di una medusa Consente di visualizzare le cellule che presentano il vettore e ne esprimono i geni Permette di tracciare i movimenti di un organismo unicellulare o di evidenziare particolari tipi di cellule in un organismo pluricellulare ori lo amp sito di origine della replicazione PGLO 5400 bp gene per la resistenza dell'ampicillina gfp Il vettore plasmidico porta il gene per la proteina fluorescente verde (GFP). VIRUS COME VETTORI Nei virus l'informazione genetica non viene mai espressa all'interno delle particelle virali I primi vettori virali sono derivati dai batteriofagi X In questi fagi non tutti i geni sono essenziali per il ciclo litico -> Si sono sviluppati dei genomi fagici privi dei geni non indispensabili e contenenti un unico sito per un enzima di restrizione In questo modo è possibile saldare all'interno del genoma virale frammenti di DNA esogeno I vettori basati sul fago possono accettare frammenti di DNA molto più lunghi rispetto i vettori plasmidi Grazie ai vettori retrovirali si può inserire stabilmente un gene all'interno del cromosoma della cellula ricevente Derivano dai retrovirus, capaci di integrare il proprio genoma all'interno del genoma della cellula infettata È possibile modificare i retrovirus in modo da renderli capaci di contenere altri geni esogeni Questi vettori verranno utilizzati per la terapia genica TRASPOSONI Trasposone: una sequenza di DNA in grado di spostarsi autonomamente da un sito cromosomico a un altro all'interno della stessa cellula Alterano la struttura dei cromosomi in due modi: Possono inserirsi direttamente all'interno di un gene, causandone l'inattivazione • Possono modificare una sequenza di DNA con funzioni regolative La presenza sui cromosomi di più copie dello stesso trasposone crea numerose regioni di omologia Stessa sequenza Per cui può avvenire la ricombinazione omologa →→>Si verifica lo scambio delle regioni cromosomiche comprese tra due copie dello stesso trasposone Fenomeno analogo al crossing-over che si verifica durante la meiosi trasposoni a dna Si trovano sia negli eucarioti sia nei procarioti Un cromosoma batterico contiene molti trasposoni-Circa 10 copie per ciascuno Es. Il moscerino Drosophila melanogaster può contenere oltre 50 copie ciascuno elemento IS D L'elemento IS si duplica e «salta in un altro punto del cromosoma. E E mRNA alterato mRNA DNA Se il trasposone cade all'interno di un gene, quest'ultimo da origine a un mRNA alterato. Cromosomi omologhi allineati XX Elementi IS: i trasposoni batterici più semplici Crossover cromosomico Costituiti da sequenze di inserzione che codificano gli enzimi (trasporasi) che gli consentono di spostarsi lungo il cromosoma Retrotrasposoni I retrovirus generano una copia a DNA a doppia elica del proprio genoma a RNA detta provirus Integrata all'interno del cromosoma cellulare, dove può permanere in stato latente per tutta la vita cellulare I retrotrasposoni sono presenti solo nelle cellule eucariotiche -> Sono residui di infezioni di antichi retrovirus che hanno colpito la cellula anche diverse generazioni prima Cromatidi ricombinanti XX • Trasposoni complessi: due sequenze IS adiacenti ad una regione codificante Spesso contiene geni per la resistenza agli antibiotici elemento IS Cromatidi non-ricombinanti altri geni elemento IS trasposone complesso Un trasposone complesso consiste di due elementi IS che fiancheggiano un altro gene o altri geni. L'intero trasposone viene copiato ed è inserito in blocco. Nel corso dell'evoluzione, tutte le specie animali sono state infettate da migliaia di retrovirusMolte volte latenti Nelle generazioni successive, il DNA provirale è stato trasmesso alla progenie CONFRONTARE I GENOMI I genomi di due organismi possono presentare solo brevi tratti in comune oppure avere estesa e regioni in cui la sequenza del DNA è identica -> I genetisti confrontano i genomi per cercare di stabilire in quale percentuale i nucleotidi sono disposti nello stesso modo È possibile avere una stima della forza di legame che tiene uniti i due filamenti misurando la temperatura necessaria a separarli nuovamente Detta "di fusione" Dipende dal numero di coppie di basi complementari tra i due filamenti →> La temperatura è proporzionale al numero di basi complementari La genomica ci consente di sequenziale i genomi e di confrontare le sequenze Uomo e scimpanzé non presentano neppure un cromosoma perfettamente identico, ma i loro corredi genetici condividono il 98% dei nucleotidi -> La percentuale si riferisce al numero di paia di basi che combaciano in una certa sequenza TRASCRITTOMICA scopo della trascrittomica è quello di studiare il genoma in azione Studio di quali e quanti geni sono espressi in un dat momento e in una particolare popolazione cellulare La prima tecnica è stata il Northern blotting Introdotta nel 1977 da James Alwine e George Stark • La miscela di mRNA cellulari veniva separata per elettroforesi e trasferita su membrana di nitrocellulosa Si poteva rilevare la presenza del gene di interesse sulla membrana dell'mRNA desiderato Tramite l'aggiunta di filamenti di mRNA (saggi di ibridazione) con sonde radioattive corrispondenti alla sequenza codificante Se emette radiazioni si ha una corrispondenza L'analisi trascrittomica sfrutta l'ibridazione degli acidi nucleici e le librerie di cDNA È necessario essere a conoscenza della sequenza del genoma di cui vogliamo analizzare l'espressione ->L'analisi trascrittomica è stata resa possibile dallo sviluppo delle tecnologie del DNA ricombinante e della genomica Es. Si conosce tutta l'informazione genetica di una cellula umana -> È possibile sintetizzare oligonucleotidi di sequenza corrispondente a una porzione di ciascun gene del genoma, che fungono da "etichetta" • Questi oligonucleotidi vengono fissati in una griglia ordinata sui microarray (sequenze con scalanature numerate) Può contenere oligonucleotidi in grado di ibridarsi a tutti i 20.000 geni di una cellula • Vengono estratti gli mRNA, convertiti in cDNA -> CDNA deil tessuti tumorali CDNA normale In modo da stabilire quante regioni sono simili, dove si trovano sui cromosomi e se corrispondono a geni o a sequenze regolative • Ciascun cDNA si ibrida alla sonda con la sequenza complementare illuminando la lastrina > Le aree della griglia corrispondenti emettono radiazioni fluorescenti La lettura dei microarray consente di stabilire quali geni sono espressi in un dato momento della vita della cellula pattern associato a una prognosi favorevole pattern associato a una prognosi sfavorevole VE • Vengono marcati con un gruppo fluorescente • Denaturati per convertirli in filamenti a singola elica • Applicati al microarray Si prepara il cDNA totale del tessuto tumorale e del tessuto normale. I cDNA sono analizzati con microarray; ogni punto corrisponde a un gene. Il colore del punto indica il livello di espressione del gene: rosso se espresso di più nelle cellule tumorali, verde se espresso meno, giallo se espresso allo stesso livello. I diversi livelli di espressione dei geni tra cellule normali e tumorali forniscono preziose indicazioni diagnostiche. Si possono confrontare due popolazioni cellulari differenti Es. Cellule normali e cellule tumorali Il segnale fluorescente è proporzionale alla quantità del cDNA presente È possibile valutare la differenza di espressione: quanto più un gene è espresso in un tipo cellulare rispetto ad un altro Questa tecnica ci consente di creare dei profili genetici per diversi tipi cellulari o per diversi tessuti (normali e patologici) • Durante questo processo, il provirus può perdere la funzione dei geni necessari a produrre nuove particelle virali • Mantiene però i geni per la trascrittasi inversa e per l'endonucleasi (in grado di tagliare il DNA) divenendo un retrotrasposone DNA trascrizione RNA retrotrascrizione dell'RNA a DNA RNA CDNA retrotrasposone sintesi del secondo filamento di DNA 2. Le cavità presenti nell gel (pozzetti) vengono riempite con le soluzioni di DNA gene per J'endonucleasi Soluzione di DNA geni per la trascrittasi inversa traduzione Enzima 1 3. L'enzima di restrizione 1 taglia il DNA una volta, producendo due frammenti A e B. retrotrasposone Enzima 2 trascrittasi inversa -endonucleasi La SCOPERTA DEI TRASPOSONI Scoperti dalla ricercatrice americana Barbara McClintock negli anni 50 Le valse il premio Nobel per la medicina nel 1983 Le pannocchie di mais presentavano delle cariossidi (chicchi) di diverso colore Alcune bianche, altre viola 4. L'enzima di restrizione 2 taglia il DNA una volta, in un sito di restrizione diverso nuova copia del retrotrasposone →→> L'allele C veniva attivato per inserzione di un trasposone, tramutandosi nell'allele c I trasposoni possono causare anche patologie ereditarie Es. In Drosophila melanogaster sono presenti dei trasposoni, gli elementi P Alcuni moscerini (ceppo P) hanno geni che ne reprimono lo spostamento • Altri moscerini (ceppo M) sono privi di trasposone e della proteina repressore -Soluzione tampone 1. Un gel di agarosio è posizionato in una camera tra due elettrodi. Enzimi inserimento del retrotrasposone ad opera dell'endonucleasi Quando lo spermatozoo di un maschio P feconda l'ovulo di una femmina M l'attività del trasposone nello zigote causa la disgenesi dell'ibrido (sterilità) Nell'uomo, l'attività di trasposoni causa malattia genetica come l'emofilia e la distrofia muscolare ELETTROFORESI Tecnica che sfrutta la capacità di alcune molecole dotate di carica di muoversi attraverso uno specifico gel immerso in un campo elettrico DNA, RNA e proteine Il gel fa da setaccio e separa le molecole in base alle loro dimensioni - Quelle più piccole si muovono più rapidamente di quelle più grandi • Gel di poliacrilammide: è una plastica utilizzata per la separazione di proteine (buchi piccoli, preciso) • Gel di agarosio: è un colloide ricavato dall'alga dell'agar-agar utilizzato per la separazione dei frammenti di acidi nucleici (buchi grandi) Polisaccaride idrosolubile ad alta temperatura, diventa un solido gelatinoso quando si raffredda 5. Se sono usati entrambi gli enzimi di restrizione, vengono fatti due tagli nel DNA. La RNA polimerasi cellulare trascrive i geni del retrotrasposone Si generano Gli mRNA per la trascrittasi inversa e la endonucleasi 1+2 • Il trascritto primario corrispondente all'intero retrotrasposone Questo RNA viene riconosciuto dalla trascrittasi inversa 6. Dopo l'incubazione con l'enzima, ogni campione viene caricato in un pozzetto del gel. L'endonucleasi induce un taglio in un nuovo sito cromosomico e vi inserisce la nuova copia a DNA del retrotrasposone Quindi, i retrotrasposoni ripercorrono le prime fasi della replicazione del retrovirus da cui sono derivati -> Ma non sono più in grado di compiere un ciclo litico Controllato da un gene, responsabile del colore viola nella sua versione normale C o dell'assenza di colore nella versione mutata c Ne genera una copia a doppia elica di DNA 2 1+2 Frammenti più lunghi Frammenti più corti Un trasposone che entrasse in questi organismi potrebbe muoversi liberamente all'interno del genoma 7. Mentre i frammenti di DNA migrano verso il polo positivo, i frammenti più corti si muovono più velocemente (e quindi vanno più lontano) dell frammenti più lunghi. Il gel viene preparato con particolari vaschette e pettini che permettono la formazione di piccole fenditure, dette pozzetti Qui si inseriscono i campioni di DNA da analizzare Il gel viene immerso in una cella elettroforetica riempita di un apposita soluzione elettrolitica Al passaggio della corrente, i frammenti di acido nucleico (carichi negativamente per i gruppi fosfato) fuoriescono dei pozzetti e migrano nel gel diretti verso il polo positivo Grazie a degli appositi coloranti, si può visualizzare la posizione che ciascun frammento ha raggiunto al termine della corsa elettroforetica La distanza percorsa è inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento-> Quelli più corti hanno un peso molecolare basso e migrano velocemente Si carica sempre una miscela di vari frammenti di DNA di dimensioni conosciute Per confronto si può ricavare la dimensione degli altri segmenti di DNA Tecnica impiegata per il DNA fingerprinting Il gel di poliacrilammide si usa nell'analisi delle sieroproteine presenti nel sangue Migrano verso il polo positivo in modo inversamente proporzionale alla loro massa e direttamente proporzionale alla loro carica A differenza di quella con l'agarosio, la cella è verticale con il polo negativo in alto, così che le proteine possono scendere verso quello positivo IL CLONAGGIO Clonaggio: procedura che permette di ottenere molte copie dello stesso gene utilizzando cellule vive Passaggi fondamentali: • Digerire il DNA donatore con gli opportuni enzimi di restrizione Il frammento contenente il gene di interesse si isola • Digerire il DNA ricevente con gli stessi enzimi di restrizione - Si creano estremità coesive compatibili • Saldare il frammento di DNA esogeno al vettore tramite la DNA ligasi Trasformazione (se la cellula è batterica) o trasfezione (se la cellula è eucariotica): il plasmide ricombinante viene inserito nella cellula ricevente • Selezionare le cellule riceventi contenenti il plasmide per ottenere una coltura pura Si vogliono ottenere un gran numero di copie del gene Le cellule batteriche sono la scelta più ovvia DNA campione Consente di confrontare il DNA di individui diversi • Utilizzata nell'analisi degli RFLP (restriction fragment length polymorphism) che evidenzia le variazioni di lunghezza dei frammenti di restrizione taglio con endonucleasi di restrizione miscela dei frammenti con il DNA plasmidico che è stato anch'esso tagliato aggiunta dell'enzima ligasi Trasformazione in cellule ospiti: solamente alcune tecniche -per cellule incorporano il DNA plasmidico. Facili da trasformare e da coltivare, si moltiplicano rapidamente duplicando il plasmide in esse inserito la miscela viene sparsa su un mezzo contenente antibiotico le cellule contenenti i plasmidi si moltiplicano e formano colonie isolamento e analisi del DNA plasmidico Ci sono sempre cellule che non hanno incorporato il DNA esogeno Ponendo le cellule trasformate in presenza dell'antibiotico specifico, sono quelle che hanno incorporato il vettore possono sopravvivere Si ottiene una coltura pura di cellule contenenti il DNA esogeno ->Ogni volta che le cellule trasformate si dividono, duplicano oltre loro geni anche quelli contenuti nel vettore - l'inserimento del plasmide ricombinante La trasfezione di una cellula eucariotica è praticata se si vuole modificare il suo fenotipo attraverso l'espressione di un gene esogeno -> Viene utilizzato un vettore di espressione 30 Una cellula batterica si divide ogni 20 minuti circa->Partendo da una singola cellula trasformato, dopo 30 divisioni si ottengono 2 cellule geneticamente identiche o cloni I vettori plasmidici contengono un gene reporter per la resistenza a un antibiotico ->Sfruttato per la selezione delle cellule che sono state trasformate Tecnica utilizzata per la trasfezione di cellule vegetali • Trasformazione mediante shock termico. Le cellule batteriche sono immerse in una soluzione concentrata di ioni Ca²+ a bassa temperatura Attraggono il DNA plasmidico (carico negativamente) La temperatura viene innalzata oltre i 40°C è riportata in tempi brevi a 2-4°C Lo shock termico provoca la formazione di pori a livello della membrana cellulare>Ingressi per il vettore plasmidico • Elettroporazione Le cellule batteriche o eucariotiche sono sottoposte per pochi secondi a un campo elettrico Tramite voltaggi si provoca l'apertura di canali Ingressi per il vettore Pistola bio-rad per bombardamento biolistico Il DNA da inserire viene legato a nano particelle di oro o tungsteno (metalli piuttosto resistenti) Vengono sparate attraverso la parete cellulare con la pistola genica (gene gun), una pistola ad aria compressa PROTEOMICA La proteomica si occupa dell'analisi complessiva dei prodotti finali dell'espressione genica: le proteine Il proteoma può essere molto diverso tra differenti tipi cellulari o in diverse fasi della vita della cellula I gruppi di geni che vengono espressi sono diversi (₂ La variabilità ottenibile dai meccanismi di splicing e post-traduzionali è modulata a seconda del tipo cellulare Per analizzare il proteoma si deve: Rompere le cellule in modo che rilascino il loro contenuto (lisato cellulare) Si usano delle soluzioni tampone (che mantengono stabile il pH), oppure soluzioni isotoniche (stessa concentrazione), ipertoniche o ipotoniche Si ottiene la lisi • Meccanicamente, con omogeneizzatori oppure con l'applicazione di ultrasuoni • Utilizzando detergenti che sciolgano la componente lipidica della membrana Si separano le componenti più pesanti (mitocondri e membrane) dalla frazione liquida (proteine solubili) tramite centrifugazione Si ottiene una forza centrifuga fino a 100.000 volte la forza di gravità terrestre Le macromolecole tendono a disporsi in rapporto alla loro densità Le componenti più dense precipitano verso il fondo della provetta: pellet • Le componenti meno dense, come le proteine, galleggiano: surnatante L'estratto cellulare ottenuto è il materiale di partenza per l'analisi proteomica ELETTROFORESI DI PROTEINE Il DNA è un polianione: ha carica negativa Le proteine sono molecole anfotere (hanno contemporaneamente carattere acido e basico) Per la presenza degli aminoacidi Ogni amminoacido ha un valore di pH per cui la molecola assume le caratteristiche di uno ione dipolare con carica netta uguale a zero: zwitterione Punto isoelettrico (pI) dell'amminoacido Sottoponiamo a un'elettroforesi su gel una miscela di proteine a pH 7 • Quelle col pl prossimo a 7 rimangono ferme, perché prove di carica • Quelle cariche negativamente migrano verso l'anodo • Quelle cariche positivamente migrano verso il catodo La migrazione delle proteine è influenzata anche dalla loro forma tridimensionale Quelle sferiche scivolano più facilmente rispetto a quelle irregolari Accorgimenti per sviare a questi inconvenienti: • Le proteine vengono denaturate prima di essere inserite nei pozzetti Si presentano come catene lineari Si aggiunge alla miscela un detergente, il sodio-dodecil-solfato (SDS)->Si lega agli amminoacidi mantenendo la molecola denaturata È un polianione, quindi conferisce una carica netta negativa alle proteine • La migrazione delle proteine avviene sempre verso l'anodo e l loro velocità dipende dal loro peso molecolare L'elettroforesi di proteine si effettua su gel di poliacrilammide->Per questo si chiama anche SDS PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis in SDS) Le proteine vengono poi visualizzate immergendo il gel in speciali coloranti che legano gli amminoacidi WESTERN BLOTTING Tramite questo processo possiamo identificare la presenza della proteina di nostro interesse tra le altre Consiste nel loro trasferimento su un filtro di nitrocellulosa Avviene attraverso l'elettroblotting Si applica un campo elettrico al gel posto in una camera di trasferimento con il lato aderente al filtro di nitrocellulosa rivolto verso l'anodo Le proteine si muovono verso l'anodo, uscendo dal gel-Vengono intrappolate dal filtro Le caratteristiche manifestate da ogni individuo (fenotipo) sono specificate dall'informazione genetica (genotipo) Specifica e differente per ogni individuo di una certa specie Ingegneria genetica: l'insieme delle tecniche che consentono di manipolare in maniera mirata l'informazione genetica di un organismo Nel 1973, i genetisti americani Stanley Cohen e Herbert Boyer trasferirono in un batterio della specie Escherichia coli un DNA ricombinante contenente i geni per la resistenza a due antibiotici -> Il nuovo batterio era in grado di resistere a entrambi gli antibiotici mostrando un fenotipo ibrido L'ingegneria genetica si basa sull'idea che, modificando in laboratorio il genotipo degli organismi sia possibile alterarne il fenotipo in maniera mirata e non casuale come avviene in natura La tecnologia del DNA ricombinante consente di modificare molecole di DNA e poi inserirle in altre cellule utilizzando vettori I plasmidi, i virus e i trasposoni Biotecnologie Biotecnologie moderne: le applicazioni della tecnica dell'ingegneria genetica ai sistemi viventi I frammenti di DNA possono essere trasferiti anche tra specie diverse, appartenenti a regni differenti • Universalità del codice genetico: il DNA ha la stessa struttura in tutti gli esseri viventi • Un gene produce la medesima proteina indipendentemente dall'organismo in cui viene inserito Gli studi sul DNA ricombinante consentono di: Disporre di tratti di DNA sufficientemente piccoli da essere analizzati e manipolati • Ottenerne elevate quantità • Conoscere la loro sequenza nucleotidica • Identificare i segmenti genetici presi in considerazione 1. Un enzima di restrizione taglia il DNA del fago in siti specifici. Batteriofago DNA virale 2. Altri enzimi degradano il DNA fagico. Frammenti di restrizione X6 ENZIMI DI RESTRIZIONE Nel 1972, Hamilton Smith scopre un gruppo di enzimi che proteggono i batteri dalle infezioni virali: gli enzimi di restrizione 3. La presenza di gruppi metile sul cromosoma batterico impedisce agli enzimi di restrizione di tagliare il proprio DNA. Tutti gli enzimi di restrizione effettuano tagli su entrambi i filamenti del DNA • Alcuni operano tagli netti in entrambi i filamenti lasciando due estremità tronche (blunt ends) Es. Hpal • Altri tagliano i due filamenti con lo scarto di alcuni nucleotidi, generando una breve sequenza spaiata Es. EcoRI e HindIII plasmide I plasmidi tagliati sono esposti all'azione della DNA ligasi, che forma DNA ricombinante. Questi tratti sono detti estremità coesive (sticky ends) I plasmidi sono introdotti in cellule di E. col Possono riappaiarsi spontaneamente tra loro riformando i legami a idrogeno fra le basi azotate I |||| Questa cellula è resistente sia alla kanamicina sia alla tetraciclina G si tagliano i plasmidi Molte specie batteriche possono difendersi dall'infezione dei batteriofagi degradando il DNA virale grazie a questi enzimi -> Frammentano il DNA estraneo rompendo i legami 3'-5' fosfodiesterici che uniscono i nucleotidi Legami interni alle catene di DNA, quindi questi enzimi sono delle endonucleasi kan Agiscono su specifiche sequenze bersaglio (4-8 basi azotate) dette siti di restrizione o sequenze di riconoscimento Nei laboratori di genetica, vengono utilizzati più di 3000 enzimi di restrizione che agiscono come "forbici molecolari" Per ogni enzima identificato è noto anche lo specifico sito di restrizione Es. L'enzima HpaII riconosce e taglia solo la sequenza 5'-CCGG-3' GAATTE CTTAAG EcoRI AATTE Diminuiscono la possibilità di sopravvivenza del DNA esogeno che invade i procarioti CITAA tet tet" GTTAAC CAATTG Hpal estremità coesiva non si tagliano i plasmidi kon GTT AAC CỦA TIẾ O Queste cellule sono resistenti a uno solo dei due antibiotici Taglio provocato dall'enzima di restrizione 111 111 W AA GETT TTCGAA 111 Hindill AGCT TTCGA Estremità coesiva H Per rivelare la proteina di interesse si occorre al riconoscimento antigene-anticorpo: Si applica alla membrana una soluzione contenente gli anticorpi diretti contro la proteina desiderata • Si pone la membrana in una soluzione contenente un altro anticorpo (secondario) diretto contro la catena polipeptidica del primo anticorpo (primario) La si pone in una soluzione contenente il substrato. enzimatico che colora solo la banda corrispondente alla proteina a cui si era legato l'anticorpo primario L'accoppiamento western blotting e rivelazione immunologica si chiama immunoblotting Coniugato a un enzima che catalizza una reazione che genera un prodotto colorato o luminescente membrana del Western Blotting campioni a confronto anticorpo primario L'anticorpo primario è legato da un anticorpo secondario, coniugato a un enzima. 2 L'anticorpo primario riconosce e lega la proteina d'interesse. D anticorpo secondario In presenza di un substrato, l'enzima catalizza la produzione di una sostanza colorata. L'intensità del colore è proporzionale al numero di anticorpi legati e, quindi, alla quantità di proteina: in questo caso, il campione 1 è quello che contiene più proteina poiché ha la banda più intensa. visualizzazione della reazione colorimetrica • Microiniezione Il vettore plasmidico viene iniettato all'interno della cellula ricevente grazie a un minuscolo ago di vetro Tecnica utilizzata per il trasferimento di DNA esogeno all'interno di cellule embrionali La REAZIONE a CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Tecnica che isola e amplifica una specifica sequenza di DNA Si parte da una singola copia di una sequenza di DNA La si fa reagire con una DNA polimerasi -> Dopo un ciclo di reazione si ottengono due copie -> Se la reazione viene ripetuta per n cicli, le copie saranno 2 Perché la reazione abbia luogo occorrono: Il DNA stampo (un breve frammento, una miscela di cDNA o un intero genoma) che contiene la porzione di interesse Una coppia (uno all'inizio e uno alla fine) di frammenti di DNA sintetico a singola elica: oligonucleotidi o primer Forniscono l'innesco per la reazione di polimerizzazione Una DNA polimerasi termoresistente (Taq polimerasi) Il DNA genomico viene tagliato in piccoli frammenti. Le cellule di E. coli vengono trasformate Isolata da un organismo estremofilo adattato a vivere a temperature elevate Una miscela contenente 4 nucleotidi trifosfato e i contatori necessari alla DNA polimerasi dai plasmidi ricombinanti. libreria genomica mRNA CDNA LIBRERIE GENOMICHE E DI CDNA Il primo passo per isolare un gene è costruire una genoteca: una raccolta di sequenze di DNA DNA genomico plasmidi 88 cellule del batterio E. coli Gli RNA messaggeri sono copiati in cDNA mediante la trascrittasi inversa. Passaggi: • Denaturazione del DNA di partenza scaldando la miscela a temperature superiori ai 70° • Rinaturazione del DNA abbassando la temperatura • Gli oligonucleotidi, presenti in eccesso rispetto al DNA di partenza, vanno a legarsi al filamento che presenta la sequenza complementare • Successivamente vi è l'allungamento di questi inneschi da parte della DNA polimerasi • Ulteriore denaturazione che apre tutte le molecole di DNA e che consente una nuova fase di rinaturazione A ogni ciclo gli inneschi si legano sia ai filamenti originari sia a quelli via via sintetizzati dalla DNA polimerasi -> Amplificazione esponenziale libreria di cDNA Grazie al micromanipolatore che permette di effettuare movimenti di altissima precisione Una molecola di D DNA contenente una sequenza che si desidera copiare viene riscaldata a 90° e così denaturata Un vettore plasmidico si unisce a un sequenza bersaglio frammento, formando un DNA ricombinante. Ogni colonia della libreria genomica O contiene un frammento del DNA genomico originale, o un cDNA derivato da un mRNA. Quando la miscela si raffredda, inneschi ottenuti per sintesi artificiale si associano al DNA a filamento singolo. primer nuovo DNA nuovo DNA Inucleotidi trifosfato e una DNA polimerasi resistente al calore consentono la sintesi di due nuovi filamenti di DNA. D Il processo viene ripetuto e la quantità di DNA raddoppia. Grazie alla ripetizione del processo, si possono ottenere milioni di copie del DNA originale in poco tempo. Una libreria genomica è una collezione di cloni con un frammento di DNA genomico • Per isolare un gene, biologi frammentano i cromosomi umani in pezzi più piccoli Tramite gli enzimi di restrizione -> Inseriscono ciascun frammento in un vettore plasmidico con cui trasformano cellule batteriche • Ogni batterio da origine a un clone di cellule ricombinanti Contengono molte copie dello stesso frammento di DNA Nei cromosomi eucariotici, i geni sono spezzettati in esoni inframmentati da introni Il DNA genomico non è il materiale di partenza ideale per isolare un gene I biologi preferiscono costruire una genoteca partendo dagli mRNA cellulari maturi (privi di introni) -> Così da ottenere i cDNA Una libreria di cDNA è una collezione di cloni corrispondenti alle sequenze effettivamente espresse in una cellula Per isolare gli mRNA si sfrutta la presenza della coda poli-A (200 adenine) • Le cellule vengono frammentate in modo da liberare tutti gli acidi nucleici->Applicati a una resina costituita da un polimero di agarosio a cui sono attaccati oligonucleotidi sintetici poli-T (200 timine) Gli acidi nucleici che non si associano vengono lavati via • Si recuperano gli mRNA dalla colonna lavandola con appositi tamponi -> Si ottiene una collezione di tutti gli mRNA cellulari Come isolare I'mRNA di nostro interesse • Agli mRNA vengono aggiunti gli oligonucleotidi di poli-T che forniscono l'innesco per la sintesi • Dopo la sintesi, I'RNA originario viene rimosso e la DNA polimerasi sintetizza il secondo filamento di DNA (cDNA)-> Questi verranno poi clonati Le librerie di cDNA ci forniscono un'istantanea dell'insieme degli mRNA trascritti da un certo tipo di cellule in un dato momento METODI DI SEQUENZIAMENTO Il sequenziamento è la determinazione dell'identità dei nucleotidi presenti in un frammento di DNA nell'ordine in cui si presentano Metodo Sanger Metodo dovuto al biochimico britannico Frederick Sanger (1977) Genoma del batteriofago ox 174 (phi-ics-174), lungo 5375 paia di basi OR Si digerisce il genoma da sequenziare con enzimi di restrizione. In ogni miscela si formano frammenti di D lunghezza diversa, a seconda del punto in cui l'allungamento è stato interrotto dal dideossinucleotide. ddATP TTGTCGGA TTGTCGGAA TIGTCGGAAGITCA Si caricano i prodotti delle quattro reazioni nei pozzetti di un gel per l'analisi elettroforetica 3 AACAGCCTTCAAGT 5 +5 TTGT3 primer + DNA polimerasi dATP, CTP, dTTP, dGTP Procedendo dal frammento più piccolo (in basso) verso il più grande (in alto), si ricostruisce l'ordine con cui i nucleotidi sono stati incorporati ddCTP ddTTP C T I frammenti di DNA vengono uniti ai reagenti necessari per la sintesi dei filamenti complementari e suddivisi in quattro provette, ciascuna contenente uno dei quattro dideossinucleotidi ddGTP TTGTC TTGTCGGAAGT TIGTCG ITGTCGGAAGTTC ITGTCGGAAGIT ITGTCGG TTGTCGGAAG sequenziato primer La sequenza che emerge è complementare a quella che si intendeva sequenziare. Sfrutta dei nucleotidi modificati che presentano lo zucchero desossiribosio privo del gruppo ossidrilico in posizione 3': i dideossinucleotidi (ddNTPs) Una volta incorporati nella catena di DNA ne impediscono l'allungamento →→>A causa della mancanza del gruppo 3'-OH necessario alla formazione del legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo Prepara quattro miscele in cui ai desossinucleotidi (dNTPs) e aggiunge un singolo dideossinucleotide ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP Avviene la reazione di polimerizzazione • Denaturazione del DNA a doppia elica • Aggiunta di un oligonucleotide complementare a quella parte del filamento stampo Conclusione della reazione dopo che la DNA polimerasi incorpora il terminatore di catena In ogni miscela si genereranno una serie di frammenti di lunghezza crescente, ognuno terminante con lo stesso dideossinucleotide Le quattro miscele vengono caricate una di fianco all'altra su un gel di poliacrilamide per separare i diversi frammenti Siamo a conoscenza solo dell'identità dell'oligonucleotide di innesco e dell'ultimo nucleotide di ciascun frammento (dideossinucleotide) →→Dal risultato su gel possiamo leggere l'ordine in cui i nucleotidi si susseguono dal frammento più piccolo al più grande